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-	== '''E colock'''    ''"self-cycling-E. coli"'' ==	+
-	[[E colock|'''⇒Go to "E colock" English page??''']]	+
-	== Member ==	+	[["E colock" Chiba 2006|'''⇒Go to "E colock" English page??'''<br>wikiページ（英語）]]
-	[[Chiba University, Japan 2006|Chiba 2006]]	+	= Concept =
-	[[http://chem.tf.chiba-u.jp/igem/ iGEM Chiba]]	+	[[Image:Ecolock model.jpg|left|330px]]
-	'''『mu』team'''
-	*[[User:Okuyama|Shinpei Okuyama]]
-	*[[User:Katabami|Akinori Katabami]]
-	*[[User:Sugaya|Sari Sugaya]]
-	*[[User:Matsuno|Shinya Matsuno]]
-	== Concept ==	+	'''Kaiシステムを大腸菌に導入し,<br>周期的自律振動を行わせる!'''
-	シアノバクテリアのもつ、生物時計システムＫａｉを大腸菌に導入し、周期的な動作をさせる。	+
-	== How It Works ==	+	= Member =
-	[[Image:Ｅ　ｃｏｌｏｃｋ　Ｈｏｗ　ｉｔ　ｗｏｒｋｓ.jpg|right|550px]]	+	[[Chiba University, Japan 2006|Chiba 2006　wikiページ（英語）]] <br>
-		+	[http://chem.tf.chiba-u.jp/igem/ iGEM　Chiba　オフィシャルサイト（日本語）]<br>
-	'''Ｋａｉシステムの導入'''	+	'''『む』チーム'''
		+	*[[User:Okuyama|奥山　真平]]
		+	*[[User:Katabami|方波見　彰仁]]
		+	*[[User:Sugaya|菅谷　紗里]]
		+	*[[User:Matsuno|松野　伸哉]]
-	Ｋａｉシステムは最も単純で分子レベルでの解析が進んでいる、24時間周期の生体時計システムである。<br>
-	Ｋａｉシステムは３つのタンパク質ＫａｉＡ、ＫａｉＢ、ＫａｉＣの行うリン酸化サイクルであり、ＫａｉＣとリン酸化ＫａｉＣの量により周期が発生する。<br>
-	この振動は特定部位の転写を活性化するセンサーキナーゼＳａｓＡにより伝えられる。<br>
-	Ｋａｉシステムのサイクルを蛍光たんぱく質の発現量により観測する。<br>
-	== Techinical Issues ==
-	'''1.Ｋａｉオペロンの導入'''
-	Ｋａｉ遺伝子は導入が可能だが、シアノバクテリア由来なので大腸菌内でＫａｉシステムが機能するだろうか？	+	= Kai system =
		+	[[Image:Kai system.jpg|right|400px]]<br />
		+	Kaiシステムとは３つのたんぱく質(KaiA,KaiB, and KaiC)によってつくられる<br />
		+	最も単純で、分子レベルでの解明の進んでいる振動システムである。<br />
		+	しかし、シアノバクテリア内でこの振動がどのようにタンパク質の発現を制御しているかは未だ解明されていない。
		+	<br />
		+	シアノバクテリアのKaiシステムで解明されていることは以下のことである。
		+	SasAはセンサーキナーゼ＜ヒスチジンキナーゼ(HK)の１種＞であり<br />
		+	Kaiサイクルとタンパク質の周期的翻訳を繋ぐ役割を持っていると考えられている。<br />
		+	RpaAは2006年に発見されたSasAのレスポンスレギュレーター(RR)であり、<br>
		+	''rpaA''欠損株では周期的翻訳が完全に消失する。<br />
-	'''2.同調機能の欠如'''
-	シアノバクテリアは光合成により、その周期をリセットしている。これにより全体の振動が同調している。<br>
-	しかし、このリセットを行っている遺伝子は未だ同定されていないので、大腸菌の振動がバラバラになることが予想される。<br>
-	→→①LacリプレッサーをKaiAプロモーター、KaiBCプロモーターの下流に置き、Kaiの振動を止める。<br>
-	::これにより全体が同調する。
-	→→②AIが使える？？
		+	'''reference '''
		+	:*SasA : [http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WSN-4195FK3-10&_coverDate=04%2F14%2F2000&_alid=435215541&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_qd=1&_cdi=7051&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=e171c9aaba0717231fe1d4c3400fcff0| H.Iwasaki'' et al.''  Cell, Vol 101, 223-233, 2000]
-	== Option ==	+	:*RpaA : [http://www.pnas.org/cgi/content/abstract/103/32/12109?maxtoshow=&HITS=10&hits=10&RESULTFORMAT=&fulltext=RpaA&searchid=1&FIRSTINDEX=0&resourcetype=HWCIT| N.Takai ''et al.'' PNAS.2006; 103: 12109-12114]
-	'''周期の制御'''	+
-	Ｋａｉタンパク質の変異株はその周期が様々であることが報告されている。<br>
-	同様に変異株を作成し、任意の周期を持った“E clock”を作成したい。
		+	[[image:Cyanobavteria.JPG|right|210px]]
-	== Work Schedule and Progress ==	+
-	[[『mu』team activities|活動報告：８月]]<br>	+
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		+	= E.colock project =
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		+	SasAとRpaAは大腸菌のEnvZとOmpRにそれぞれ高い相同性を示している。
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		+	SasAがKai振動と作用し、RpaAがSasAにより活性化を受けると確信し、
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		+	RpaA-OmpRキメラを制作する。
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		+	このRpaA-OmpRキメラにより、Kaiシステムの振動を ''ompC'' プロモーターを使い観測する。
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		+	[[Image:Ecolock.jpg|right|400px]]<br />
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		+	= Chimera design =
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		+	一般にレスポンスレギュレーターには２つのドメインがあり、
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		+	レギュレータードメインはヒスチジンキナーゼからリン酸を受け取り、
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		+	エフェクタードメインはＤＮＡの特異的配列に結合する。
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		+	実際にRpaA-OmpRキメラライブラリーを作製した。
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		+	これらのキメラは全てカッティングポイントが違うが、
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		+	SasAからシグナルを受け取るため、RpaAのレシーバードメインを持ち、
		+
		+	''OmpC'' プロモーターに結合し、活性化するため、OmpRのＤＮＡ結合ドメインを持っている。
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		+	キメラ制作手法(↓)
		+
		+	6種類のエキサイトＰＣＲプライマーをそれぞれRpaAとOmpRに対して作製。
		+	エキサイトＰＣＲにより6 ×6 = 36 種類のキメラを作製!!
		+	[[Image:Excite PCR.JPG|600px]]
		+
		+
		+
		+
		+	= Next step(＊_＊)/ =
		+
		+	キメラの作製を完了!
		+	キメラをWT RpaAとWT OmpRと供に''ompC''プロモーターのＯＮ/ＯＦＦをスイッチできるか、
		+	レスポンスレギュレーターとしての機能をテストする。
		+
		+
		+	[[Image:Jikkensitai.JPG|600px]]
		+
		+
		+	実際にKaiサイクルの振動を拾い出すことのできるキメラを見つける。
		+
		+	= Experiments =
		+	*プロモーター比較実験
		+	**pBad/araCプロモーター
		+	**lacIプロモーター
		+	**ompCプロモーター
		+
		+	= Last up date  =
		+	11/15

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Latest revision as of 01:46, 16 November 2006

Contents 1 E colock "self-cycling-E. coli" 2 Concept 3 Member 4 Kai system 5 E.colock project 6 Chimera design 7 Next step(＊_＊)/ 8 Experiments 9 Last up date

E colock "self-cycling-E. coli"

⇒Go to "E colock" English page??
wikiページ（英語）

Concept

Kaiシステムを大腸菌に導入し,
周期的自律振動を行わせる!

Member

Chiba 2006　wikiページ（英語）
[http://chem.tf.chiba-u.jp/igem/ iGEM　Chiba　オフィシャルサイト（日本語）]
『む』チーム

• 奥山　真平
• 方波見　彰仁
• 菅谷　紗里
• 松野　伸哉

Kai system

Kaiシステムとは３つのたんぱく質(KaiA,KaiB, and KaiC)によってつくられる
最も単純で、分子レベルでの解明の進んでいる振動システムである。
しかし、シアノバクテリア内でこの振動がどのようにタンパク質の発現を制御しているかは未だ解明されていない。
シアノバクテリアのKaiシステムで解明されていることは以下のことである。 SasAはセンサーキナーゼ＜ヒスチジンキナーゼ(HK)の１種＞であり
Kaiサイクルとタンパク質の周期的翻訳を繋ぐ役割を持っていると考えられている。
RpaAは2006年に発見されたSasAのレスポンスレギュレーター(RR)であり、
rpaA欠損株では周期的翻訳が完全に消失する。

reference

• SasA : [http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WSN-4195FK3-10&_coverDate=04%2F14%2F2000&_alid=435215541&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_qd=1&_cdi=7051&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=e171c9aaba0717231fe1d4c3400fcff0| H.Iwasaki et al. Cell, Vol 101, 223-233, 2000]

• RpaA : [http://www.pnas.org/cgi/content/abstract/103/32/12109?maxtoshow=&HITS=10&hits=10&RESULTFORMAT=&fulltext=RpaA&searchid=1&FIRSTINDEX=0&resourcetype=HWCIT| N.Takai et al. PNAS.2006; 103: 12109-12114]

E.colock project

SasAとRpaAは大腸菌のEnvZとOmpRにそれぞれ高い相同性を示している。

SasAがKai振動と作用し、RpaAがSasAにより活性化を受けると確信し、

RpaA-OmpRキメラを制作する。

このRpaA-OmpRキメラにより、Kaiシステムの振動を ompC プロモーターを使い観測する。

Chimera design

一般にレスポンスレギュレーターには２つのドメインがあり、

レギュレータードメインはヒスチジンキナーゼからリン酸を受け取り、

エフェクタードメインはＤＮＡの特異的配列に結合する。

実際にRpaA-OmpRキメラライブラリーを作製した。

これらのキメラは全てカッティングポイントが違うが、

SasAからシグナルを受け取るため、RpaAのレシーバードメインを持ち、

OmpC プロモーターに結合し、活性化するため、OmpRのＤＮＡ結合ドメインを持っている。

キメラ制作手法(↓)

6種類のエキサイトＰＣＲプライマーをそれぞれRpaAとOmpRに対して作製。 エキサイトＰＣＲにより6 ×6 = 36 種類のキメラを作製!!

Next step(＊_＊)/

キメラの作製を完了! キメラをWT RpaAとWT OmpRと供にompCプロモーターのＯＮ/ＯＦＦをスイッチできるか、 レスポンスレギュレーターとしての機能をテストする。

実際にKaiサイクルの振動を拾い出すことのできるキメラを見つける。

Experiments

• プロモーター比較実験
  • pBad/araCプロモーター
  • lacIプロモーター
  • ompCプロモーター

Last up date

11/15