E colock

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:*SasA : [http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WSN-4195FK3-10&_coverDate=04%2F14%2F2000&_alid=435215541&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_qd=1&_cdi=7051&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=e171c9aaba0717231fe1d4c3400fcff0| H.Iwasaki'' et al.''  Cell, Vol 101, 223-233, 2000]
:*SasA : [http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WSN-4195FK3-10&_coverDate=04%2F14%2F2000&_alid=435215541&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_qd=1&_cdi=7051&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=e171c9aaba0717231fe1d4c3400fcff0| H.Iwasaki'' et al.''  Cell, Vol 101, 223-233, 2000]
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:*RpaA : [http://www.pnas.org/cgi/content/abstract/103/32/12109| N.Takai ''et al.'' PNAS.2006; 103: 12109-12114]
+
:*RpaA : [http://www.pnas.org/cgi/content/abstract/103/32/12109?maxtoshow=&HITS=10&hits=10&RESULTFORMAT=&fulltext=RpaA&searchid=1&FIRSTINDEX=0&resourcetype=HWCIT| N.Takai ''et al.'' PNAS.2006; 103: 12109-12114]

Latest revision as of 01:46, 16 November 2006

Contents

E colock "self-cycling-E. coli"

⇒Go to "E colock" English page??
wikiページ(英語)

Concept

Ecolock model.jpg


Kaiシステムを大腸菌に導入し,
周期的自律振動を行わせる!

Member

Chiba 2006 wikiページ(英語)
iGEM Chiba オフィシャルサイト(日本語)
『む』チーム



Kai system

Kai system.jpg

Kaiシステムとは3つのたんぱく質(KaiA,KaiB, and KaiC)によってつくられる
最も単純で、分子レベルでの解明の進んでいる振動システムである。
しかし、シアノバクテリア内でこの振動がどのようにタンパク質の発現を制御しているかは未だ解明されていない。
シアノバクテリアのKaiシステムで解明されていることは以下のことである。 SasAはセンサーキナーゼ<ヒスチジンキナーゼ(HK)の1種>であり
Kaiサイクルとタンパク質の周期的翻訳を繋ぐ役割を持っていると考えられている。
RpaAは2006年に発見されたSasAのレスポンスレギュレーター(RR)であり、
rpaA欠損株では周期的翻訳が完全に消失する。




reference


Cyanobavteria.JPG






E.colock project

SasAとRpaAは大腸菌のEnvZとOmpRにそれぞれ高い相同性を示している。

SasAがKai振動と作用し、RpaAがSasAにより活性化を受けると確信し、

RpaA-OmpRキメラを制作する。

このRpaA-OmpRキメラにより、Kaiシステムの振動を ompC プロモーターを使い観測する。

Ecolock.jpg







Chimera design

一般にレスポンスレギュレーターには2つのドメインがあり、

レギュレータードメインはヒスチジンキナーゼからリン酸を受け取り、

エフェクタードメインはDNAの特異的配列に結合する。


実際にRpaA-OmpRキメラライブラリーを作製した。

これらのキメラは全てカッティングポイントが違うが、

SasAからシグナルを受け取るため、RpaAのレシーバードメインを持ち、

OmpC プロモーターに結合し、活性化するため、OmpRのDNA結合ドメインを持っている。


キメラ制作手法(↓)

6種類のエキサイトPCRプライマーをそれぞれRpaAとOmpRに対して作製。 エキサイトPCRにより6 ×6 = 36 種類のキメラを作製!! Excite PCR.JPG



Next step(*_*)/

キメラの作製を完了! キメラをWT RpaAとWT OmpRと供にompCプロモーターのON/OFFをスイッチできるか、 レスポンスレギュレーターとしての機能をテストする。


Jikkensitai.JPG


実際にKaiサイクルの振動を拾い出すことのできるキメラを見つける。

Experiments

  • プロモーター比較実験
    • pBad/araCプロモーター
    • lacIプロモーター
    • ompCプロモーター

Last up date

11/15

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