E colock
From 2006.igem.org
Contents |
E colock "self-cycling-E. coli"
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wikiページ（英語）
Concept
Kaiシステムを大腸菌に導入し,
周期的自律振動を行わせる!
Member
Chiba 2006 wikiページ（英語）
[http://chem.tf.chiba-u.jp/igem/ iGEM Chiba オフィシャルサイト（日本語）]
『む』チーム
Kaiシステム
Kaiシステムとは３つのたんぱく質(KaiA,KaiB, and KaiC)によってつくられる
最も単純で、分子レベルでの解明の進んでいる振動システムである。
しかし、シアノバクテリア内でこの振動がどのようにタンパク質の発現を制御しているかは分かっていない。
SasAはセンサーキナーゼであり、ヒスチジンキナーゼ(HK)の１種であり、
Kaiサイクルとタンパク質の周期的翻訳を繋ぐ役割を持っていると考えられている。
RpaAは2006年に発見されたSasAのレスポンスレギュレーター(RR)であり、
rpaA欠損株では周期的翻訳が完全に消失する。
文献
E.colock プロジェクト
SasAとRpaAは大腸菌のEnvZとOmpRにそれぞれ高い相同性を示している。
SasAがKai振動と作用し、RpaAがSasAにより活性化を受けると確信し、
RpaA-OmpRキメラをつくる。
このRpaA-OmpRキメラにより、Kaiシステムの振動を ompC プロモーターを使い観測する。
キメラデザイン
一般にレスポンスレギュレーターには２つのドメインがあり、
レギュレータードメインはヒスチジンキナーゼからリン酸を受け取り、
エフェクタードメインはＤＮＡの特異的配列に結合する。
実際に36種類のRpaA-OmpRキメラを作製した。
これらのキメラは全てカッティングポイントが違うが、
SasAからシグナルを受け取るため、RpaAのレシーバードメインを持ち、
OmpC プロモーターに結合し、活性化するため、OmpRのＤＮＡ結合ドメインを持っている。
キメラ制作手法(↓)
6種類のエキサイトＰＣＲプライマーをそれぞれRpaAとOmpRに対して作製。
エキサイトＰＣＲにより6 ×6 = 36 種類のキメラを作製!!
Next step (＊_＊)/
The construct of chimeras is finished! Chimaras along with WT RpaA and OmpR will be tested in their function as response regulator that switch ON/OFF the ompCpromoter.
We will find some chimeras indeed pick up Kai cycle.
Last up date
- 11/15
