E colock

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Kaiシステムとは３つのたんぱく質(KaiA,KaiB, and KaiC)によってつくられる<br />
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最も単純で、分子レベルでの解明の進んでいる振動システムである。<br />
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しかし、シアノバクテリア内でこの振動がどのようにタンパク質の発現を制御しているかは分かっていない。
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SasAはセンサーキナーゼであり、ヒスチジンキナーゼ(HK)の１種であり、<br />
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シアノバクテリアのKaiシステムで解明されていることは以下のことである。
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SasAはセンサーキナーゼ＜ヒスチジンキナーゼ(HK)の１種＞であり<br />
Kaiサイクルとタンパク質の周期的翻訳を繋ぐ役割を持っていると考えられている。<br />
Kaiサイクルとタンパク質の周期的翻訳を繋ぐ役割を持っていると考えられている。<br />
RpaAは2006年に発見されたSasAのレスポンスレギュレーター(RR)であり、<br>
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:*SasA : [http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WSN-4195FK3-10&_coverDate=04%2F14%2F2000&_alid=435215541&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_qd=1&_cdi=7051&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=e171c9aaba0717231fe1d4c3400fcff0| H.Iwasaki'' et al.''  Cell, Vol 101, 223-233, 2000]
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:*
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:*RpaA : [http://www.pnas.org/cgi/content/abstract/103/32/12109?maxtoshow=&HITS=10&hits=10&RESULTFORMAT=&fulltext=RpaA&searchid=1&FIRSTINDEX=0&resourcetype=HWCIT| N.Takai ''et al.'' PNAS.2006; 103: 12109-12114]
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= E.colock プロジェクト =
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= E.colock project =
SasAとRpaAは大腸菌のEnvZとOmpRにそれぞれ高い相同性を示している。
SasAとRpaAは大腸菌のEnvZとOmpRにそれぞれ高い相同性を示している。
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SasAがKai振動と作用し、RpaAがSasAにより活性化を受けると確信し、
SasAがKai振動と作用し、RpaAがSasAにより活性化を受けると確信し、
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RpaA-OmpRキメラをつくる。
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RpaA-OmpRキメラを制作する。
このRpaA-OmpRキメラにより、Kaiシステムの振動を ''ompC'' プロモーターを使い観測する。
このRpaA-OmpRキメラにより、Kaiシステムの振動を ''ompC'' プロモーターを使い観測する。
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= キメラデザイン =
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= Chimera design =
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In general, Response Regulator has 2 domeins,
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一般にレスポンスレギュレーターには２つのドメインがあり、
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regulator domein receives phospate from Hiatidine Kinase and effector domein bind to specific sequence of DNA.
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レギュレータードメインはヒスチジンキナーゼからリン酸を受け取り、
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We create 36 chimera of RpaA-OmpR.
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エフェクタードメインはＤＮＡの特異的配列に結合する。
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There are different in cutting point, but all of them have recerver domein of RpaA to communicate
 
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SasA,and DNA-binding domein of OmpR to bind and activete right to ''OmpC'' promoter.
 
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実際にRpaA-OmpRキメラライブラリーを作製した。
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The precedure(↓)
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これらのキメラは全てカッティングポイントが違うが、
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We used 6 excite primers on each RpaA and OmpR，
+
SasAからシグナルを受け取るため、RpaAのレシーバードメインを持ち、
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It can make 6 ×6 = 36 different chimeras!!
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[[Image:Excite PCR.JPG|600px]]
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''OmpC'' プロモーターに結合し、活性化するため、OmpRのＤＮＡ結合ドメインを持っている。
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キメラ制作手法(↓)
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6種類のエキサイトＰＣＲプライマーをそれぞれRpaAとOmpRに対して作製。
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エキサイトＰＣＲにより6 ×6 = 36 種類のキメラを作製!!
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[[Image:Excite PCR.JPG|600px]]
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= Next step (＊_＊)/ =
 
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The construct of chimeras is finished!
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= Next step(＊_＊)/ =
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Chimaras along with WT RpaA and OmpR will be tested in their function as response regulator that switch ON/OFF the ''ompC''promoter.
+
 +
キメラの作製を完了!
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キメラをWT RpaAとWT OmpRと供に''ompC''プロモーターのＯＮ/ＯＦＦをスイッチできるか、
 +
レスポンスレギュレーターとしての機能をテストする。
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We will find some chimeras indeed pick up Kai cycle.
+
実際にKaiサイクルの振動を拾い出すことのできるキメラを見つける。
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= Experiments =
 +
*プロモーター比較実験
 +
**pBad/araCプロモーター
 +
**lacIプロモーター
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**ompCプロモーター
= Last up date  =
= Last up date  =
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*11/15
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Latest revision as of 01:46, 16 November 2006

Contents

E colock "self-cycling-E. coli"

⇒Go to "E colock" English page??
wikiページ（英語）

Concept

Ecolock model.jpg


Kaiシステムを大腸菌に導入し,
周期的自律振動を行わせる!

Member

Chiba 2006　wikiページ（英語）
[http://chem.tf.chiba-u.jp/igem/ iGEM　Chiba　オフィシャルサイト（日本語）]
『む』チーム



Kai system

Kai system.jpg

Kaiシステムとは３つのたんぱく質(KaiA,KaiB, and KaiC)によってつくられる
最も単純で、分子レベルでの解明の進んでいる振動システムである。
しかし、シアノバクテリア内でこの振動がどのようにタンパク質の発現を制御しているかは未だ解明されていない。
シアノバクテリアのKaiシステムで解明されていることは以下のことである。 SasAはセンサーキナーゼ＜ヒスチジンキナーゼ(HK)の１種＞であり
Kaiサイクルとタンパク質の周期的翻訳を繋ぐ役割を持っていると考えられている。
RpaAは2006年に発見されたSasAのレスポンスレギュレーター(RR)であり、
rpaA欠損株では周期的翻訳が完全に消失する。




reference

  • SasA : [http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WSN-4195FK3-10&_coverDate=04%2F14%2F2000&_alid=435215541&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_qd=1&_cdi=7051&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=e171c9aaba0717231fe1d4c3400fcff0| H.Iwasaki et al. Cell, Vol 101, 223-233, 2000]
  • RpaA : [http://www.pnas.org/cgi/content/abstract/103/32/12109?maxtoshow=&HITS=10&hits=10&RESULTFORMAT=&fulltext=RpaA&searchid=1&FIRSTINDEX=0&resourcetype=HWCIT| N.Takai et al. PNAS.2006; 103: 12109-12114]


Cyanobavteria.JPG






E.colock project

SasAとRpaAは大腸菌のEnvZとOmpRにそれぞれ高い相同性を示している。

SasAがKai振動と作用し、RpaAがSasAにより活性化を受けると確信し、

RpaA-OmpRキメラを制作する。

このRpaA-OmpRキメラにより、Kaiシステムの振動を ompC プロモーターを使い観測する。

Ecolock.jpg







Chimera design

一般にレスポンスレギュレーターには２つのドメインがあり、

レギュレータードメインはヒスチジンキナーゼからリン酸を受け取り、

エフェクタードメインはＤＮＡの特異的配列に結合する。


実際にRpaA-OmpRキメラライブラリーを作製した。

これらのキメラは全てカッティングポイントが違うが、

SasAからシグナルを受け取るため、RpaAのレシーバードメインを持ち、

OmpC プロモーターに結合し、活性化するため、OmpRのＤＮＡ結合ドメインを持っている。


キメラ制作手法(↓)

6種類のエキサイトＰＣＲプライマーをそれぞれRpaAとOmpRに対して作製。 エキサイトＰＣＲにより6 ×6 = 36 種類のキメラを作製!! Excite PCR.JPG



Next step(＊_＊)/

キメラの作製を完了! キメラをWT RpaAとWT OmpRと供にompCプロモーターのＯＮ/ＯＦＦをスイッチできるか、 レスポンスレギュレーターとしての機能をテストする。


Jikkensitai.JPG


実際にKaiサイクルの振動を拾い出すことのできるキメラを見つける。

Experiments

  • プロモーター比較実験
    • pBad/araCプロモーター
    • lacIプロモーター
    • ompCプロモーター

Last up date

11/15

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