E colock

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'''Installing Kai system,<br>E.coli starts oscillating!'''
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'''Kaiシステムを大腸菌に導入し,<br>周期的自律振動を行わせる!'''
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[[Chiba University, Japan 2006|Chiba 2006　wikiページ（英語）]] <br>
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'''『む』チーム'''
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*[[User:Okuyama|奥山　真平]]  
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Kai system is generated by 3 proteins(KaiA,KaiB, and KaiC).<br />
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Kaiシステムとは３つのたんぱく質(KaiA,KaiB, and KaiC)によってつくられる<br />
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This is the most simplest circardian oscillation system.<br />
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最も単純で、分子レベルでの解明の進んでいる振動システムである。<br />
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But,it is not known how this oscillation regulate global expression of many proteins in cyanobacteria.
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しかし、シアノバクテリア内でこの振動がどのようにタンパク質の発現を制御しているかは未だ解明されていない。
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SasA is a Sensory Kinase(a kind of Histidine Kinase).<br />
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シアノバクテリアのKaiシステムで解明されていることは以下のことである。
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SasA is believed to connect with Kai cycle and transcriptional oscillation of many proteins.<br />
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SasAはセンサーキナーゼ＜ヒスチジンキナーゼ(HK)の１種＞であり<br />
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RpaA is coganate response regulator for SasA, and it's deletion results in the complete loss of transcription oscillation.<br />
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Kaiサイクルとタンパク質の周期的翻訳を繋ぐ役割を持っていると考えられている。<br />
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This is all known about Kai.
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RpaAは2006年に発見されたSasAのレスポンスレギュレーター(RR)であり、<br>
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''rpaA''欠損株では周期的翻訳が完全に消失する。<br />
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'''reference '''
'''reference '''
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:*
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:*SasA : [http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WSN-4195FK3-10&_coverDate=04%2F14%2F2000&_alid=435215541&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_qd=1&_cdi=7051&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=e171c9aaba0717231fe1d4c3400fcff0| H.Iwasaki'' et al.''  Cell, Vol 101, 223-233, 2000]
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:*
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:*RpaA : [http://www.pnas.org/cgi/content/abstract/103/32/12109?maxtoshow=&HITS=10&hits=10&RESULTFORMAT=&fulltext=RpaA&searchid=1&FIRSTINDEX=0&resourcetype=HWCIT| N.Takai ''et al.'' PNAS.2006; 103: 12109-12114]
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= E.colock Project =
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= E.colock project =
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SasA and RpaA is highly homologous to EnvZ and OmpR,respectively.
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SasAとRpaAは大腸菌のEnvZとOmpRにそれぞれ高い相同性を示している。
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Believing that SasA is communicating with Kai oscillator.
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SasAがKai振動と作用し、RpaAがSasAにより活性化を受けると確信し、
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Believing that RpaA communicate with SasA.
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RpaA-OmpRキメラを制作する。
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We designed RpaA-OmpR chimera,in hope that we read our Kai oscillation using ''ompC'' promoter.
+
このRpaA-OmpRキメラにより、Kaiシステムの振動を ''ompC'' プロモーターを使い観測する。
[[Image:Ecolock.jpg|right|400px]]<br />
[[Image:Ecolock.jpg|right|400px]]<br />
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= Chimera design =
= Chimera design =
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In general, Response Regulator has 2 domeins,
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一般にレスポンスレギュレーターには２つのドメインがあり、
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regulator domein receives phospate from Hiatidine Kinase and effector domein bind to specific sequence of DNA.
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レギュレータードメインはヒスチジンキナーゼからリン酸を受け取り、
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We create 36 chimera of RpaA-OmpR.
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エフェクタードメインはＤＮＡの特異的配列に結合する。
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There are different in cutting point, but all of them have recerver domein of RpaA to communicate
 
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SasA,and DNA-binding domein of OmpR to bind and activete right to ''OmpC'' promoter.
 
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実際にRpaA-OmpRキメラライブラリーを作製した。
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The precedure(↓)
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これらのキメラは全てカッティングポイントが違うが、
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We used 6 excite primers on each RpaA and OmpR，
+
SasAからシグナルを受け取るため、RpaAのレシーバードメインを持ち、
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It can make 6 ×6 = 36 different chimeras!!
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[[Image:Excite PCR.JPG|600px]]
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''OmpC'' プロモーターに結合し、活性化するため、OmpRのＤＮＡ結合ドメインを持っている。
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キメラ制作手法(↓)
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6種類のエキサイトＰＣＲプライマーをそれぞれRpaAとOmpRに対して作製。
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エキサイトＰＣＲにより6 ×6 = 36 種類のキメラを作製!!
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[[Image:Excite PCR.JPG|600px]]
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= Next step (＊_＊)/ =
 
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The construct of chimeras is finished!
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= Next step(＊_＊)/ =
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Chimaras along with WT RpaA and OmpR will be tested in their function as response regulator that switch ON/OFF the ''ompC''promoter.
+
 +
キメラの作製を完了!
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キメラをWT RpaAとWT OmpRと供に''ompC''プロモーターのＯＮ/ＯＦＦをスイッチできるか、
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レスポンスレギュレーターとしての機能をテストする。
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We will find some chimeras indeed pick up Kai cycle.
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実際にKaiサイクルの振動を拾い出すことのできるキメラを見つける。
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= Experiments =
 +
*プロモーター比較実験
 +
**pBad/araCプロモーター
 +
**lacIプロモーター
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**ompCプロモーター
= Last up date  =
= Last up date  =
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*11/15
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11/15

Latest revision as of 01:46, 16 November 2006

Contents

E colock "self-cycling-E. coli"

⇒Go to "E colock" English page??
wikiページ（英語）

Concept

Ecolock model.jpg


Kaiシステムを大腸菌に導入し,
周期的自律振動を行わせる!

Member

Chiba 2006　wikiページ（英語）
[http://chem.tf.chiba-u.jp/igem/ iGEM　Chiba　オフィシャルサイト（日本語）]
『む』チーム



Kai system

Kai system.jpg

Kaiシステムとは３つのたんぱく質(KaiA,KaiB, and KaiC)によってつくられる
最も単純で、分子レベルでの解明の進んでいる振動システムである。
しかし、シアノバクテリア内でこの振動がどのようにタンパク質の発現を制御しているかは未だ解明されていない。
シアノバクテリアのKaiシステムで解明されていることは以下のことである。 SasAはセンサーキナーゼ＜ヒスチジンキナーゼ(HK)の１種＞であり
Kaiサイクルとタンパク質の周期的翻訳を繋ぐ役割を持っていると考えられている。
RpaAは2006年に発見されたSasAのレスポンスレギュレーター(RR)であり、
rpaA欠損株では周期的翻訳が完全に消失する。




reference

  • SasA : [http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WSN-4195FK3-10&_coverDate=04%2F14%2F2000&_alid=435215541&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_qd=1&_cdi=7051&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=e171c9aaba0717231fe1d4c3400fcff0| H.Iwasaki et al. Cell, Vol 101, 223-233, 2000]
  • RpaA : [http://www.pnas.org/cgi/content/abstract/103/32/12109?maxtoshow=&HITS=10&hits=10&RESULTFORMAT=&fulltext=RpaA&searchid=1&FIRSTINDEX=0&resourcetype=HWCIT| N.Takai et al. PNAS.2006; 103: 12109-12114]


Cyanobavteria.JPG






E.colock project

SasAとRpaAは大腸菌のEnvZとOmpRにそれぞれ高い相同性を示している。

SasAがKai振動と作用し、RpaAがSasAにより活性化を受けると確信し、

RpaA-OmpRキメラを制作する。

このRpaA-OmpRキメラにより、Kaiシステムの振動を ompC プロモーターを使い観測する。

Ecolock.jpg







Chimera design

一般にレスポンスレギュレーターには２つのドメインがあり、

レギュレータードメインはヒスチジンキナーゼからリン酸を受け取り、

エフェクタードメインはＤＮＡの特異的配列に結合する。


実際にRpaA-OmpRキメラライブラリーを作製した。

これらのキメラは全てカッティングポイントが違うが、

SasAからシグナルを受け取るため、RpaAのレシーバードメインを持ち、

OmpC プロモーターに結合し、活性化するため、OmpRのＤＮＡ結合ドメインを持っている。


キメラ制作手法(↓)

6種類のエキサイトＰＣＲプライマーをそれぞれRpaAとOmpRに対して作製。 エキサイトＰＣＲにより6 ×6 = 36 種類のキメラを作製!! Excite PCR.JPG



Next step(＊_＊)/

キメラの作製を完了! キメラをWT RpaAとWT OmpRと供にompCプロモーターのＯＮ/ＯＦＦをスイッチできるか、 レスポンスレギュレーターとしての機能をテストする。


Jikkensitai.JPG


実際にKaiサイクルの振動を拾い出すことのできるキメラを見つける。

Experiments

  • プロモーター比較実験
    • pBad/araCプロモーター
    • lacIプロモーター
    • ompCプロモーター

Last up date

11/15

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