E colock
From 2006.igem.org
Contents |
E colock "self-cycling-E. coli"
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wikiページ（英語）
Concept
Kaiシステムを大腸菌に導入し,
周期的自律振動を行わせる!
Member
Chiba 2006 wikiページ（英語）
[http://chem.tf.chiba-u.jp/igem/ iGEM Chiba オフィシャルサイト（日本語）]
『む』チーム
Kai system
Kaiシステムとは３つのたんぱく質(KaiA,KaiB, and KaiC)によってつくられる
最も単純で、分子レベルでの解明の進んでいる振動システムである。
しかし、シアノバクテリア内でこの振動がどのようにタンパク質の発現を制御しているかは未だ解明されていない。
シアノバクテリアのKaiシステムで解明されていることは以下のことである。
SasAはセンサーキナーゼ＜ヒスチジンキナーゼ(HK)の１種＞であり
Kaiサイクルとタンパク質の周期的翻訳を繋ぐ役割を持っていると考えられている。
RpaAは2006年に発見されたSasAのレスポンスレギュレーター(RR)であり、
rpaA欠損株では周期的翻訳が完全に消失する。
reference
- SasA : [http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WSN-4195FK3-10&_coverDate=04%2F14%2F2000&_alid=435215541&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_qd=1&_cdi=7051&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=e171c9aaba0717231fe1d4c3400fcff0| H.Iwasaki et al. Cell, Vol 101, 223-233, 2000]
- RpaA : [http://www.pnas.org/cgi/content/abstract/103/32/12109?maxtoshow=&HITS=10&hits=10&RESULTFORMAT=&fulltext=RpaA&searchid=1&FIRSTINDEX=0&resourcetype=HWCIT| N.Takai et al. PNAS.2006; 103: 12109-12114]
E.colock project
SasAとRpaAは大腸菌のEnvZとOmpRにそれぞれ高い相同性を示している。
SasAがKai振動と作用し、RpaAがSasAにより活性化を受けると確信し、
RpaA-OmpRキメラを制作する。
このRpaA-OmpRキメラにより、Kaiシステムの振動を ompC プロモーターを使い観測する。
Chimera design
一般にレスポンスレギュレーターには２つのドメインがあり、
レギュレータードメインはヒスチジンキナーゼからリン酸を受け取り、
エフェクタードメインはＤＮＡの特異的配列に結合する。
実際にRpaA-OmpRキメラライブラリーを作製した。
これらのキメラは全てカッティングポイントが違うが、
SasAからシグナルを受け取るため、RpaAのレシーバードメインを持ち、
OmpC プロモーターに結合し、活性化するため、OmpRのＤＮＡ結合ドメインを持っている。
キメラ制作手法(↓)
6種類のエキサイトＰＣＲプライマーをそれぞれRpaAとOmpRに対して作製。
エキサイトＰＣＲにより6 ×6 = 36 種類のキメラを作製!!
Next step(＊_＊)/
キメラの作製を完了! キメラをWT RpaAとWT OmpRと供にompCプロモーターのＯＮ/ＯＦＦをスイッチできるか、 レスポンスレギュレーターとしての機能をテストする。
実際にKaiサイクルの振動を拾い出すことのできるキメラを見つける。
Experiments
- プロモーター比較実験
- pBad/araCプロモーター
- lacIプロモーター
- ompCプロモーター
Last up date
11/15
